调控自噬水平对扩张型心肌病大鼠心功能的影响及其机制探讨

【摘要】第一部分Lewis大鼠扩张型心肌病模型的建立及评估[目的]建立Lewis大鼠扩张型心肌病模型。[方法]Lewis大鼠,周龄8周,于双后足足垫注射猪心肌凝蛋白1mg/只,常规喂养8周后行大鼠超声心动图评估心功能。取心肌组织行HE染色、Masson染色观察心肌组织病理改变。行透射电镜观察超微结构变化及自噬水平改变。行TUNEL检测观察心肌细胞凋亡。[结果]与对照组相比(EF=81.34±3.8%),模型组lewis大鼠超声心动图检查发现心功能减退(EF=56.1±3.3%)。光镜下模型组大鼠出现明显的扩张型心肌病改变,心肌细胞肥大,胶原纤维沉积。电镜下见模型组心肌细胞排列紊乱,线粒体堆积,呈空泡化,自噬增多。TUNEL检测发现模型组心肌细胞凋亡亦增多。[结论]Lewis大鼠经足垫注射猪心肌肌凝蛋白制造扩张型心肌病模型成功。扩张型心肌病模型中自噬增多。第二部分上调自噬水平对扩张型心肌病大鼠心功能的影响及其机制探讨[目的]明确扩张型心肌病大鼠心肌细胞中自噬水平增高的意义,观察上调自噬水平对扩张型心肌病大鼠心功能的影响。[方法]建立大鼠扩张型心肌病模型,给予mTOR抑制剂雷帕霉素上调自噬,分别给予小剂量雷帕霉素(1mg/kg.d),中剂量雷帕霉素(2mg/kg.d),大剂量雷帕霉素(4mg/kg.d),腹腔注射共2周。超声心动图检测大鼠心功能改变,HE染色及Masson染色观察心肌病理改变、心肌纤维化程度,Western检测mTOR通路p70s6k、4E-BP1蛋白质磷酸化水平变化及自噬相关蛋白LC3BI/II表达水平变化,电镜下观察自噬小体。TUNEL检测心肌细胞凋亡。[结果]超声心动图发现,模型组和大剂量雷帕霉素组大鼠心功能与对照组(EF=81.3±3.8%)相比均出现明显下降,分别为(EF=56.1±3.3%)和(EF=55.9±3.6%),但在小剂量组和中剂量组却有所好转,分别为(EF=64.9±4.6%)和(EF=69.4±4.4%)。Western检测发现雷帕霉素各组中p70s6k和4E-BP1蛋白质磷酸化水平均降低,LC3BⅠ/Ⅱ表达均增加。雷帕霉素各组中自噬小体易见。但是大剂量雷帕霉素大鼠死亡率增高。TUNEL检测同时发现雷帕霉素各组心肌细胞凋亡增多。[结论]雷帕霉素诱导自噬可以改善扩张型心肌病大鼠左心收缩功能,但其安全有效范围较小,大剂量雷帕霉素不仅不能改善心功能,而且导致死亡率上升。诱导自噬的同时,心肌细胞凋亡水平是增高的。第三部分下调自噬水平对扩张型心肌病大鼠心功能的影响及其机制探讨[目的]明确扩张型心肌病大鼠心肌细胞中自噬水平增高的意义,观察下调自噬水平对大鼠扩张型心肌病心功能的影响。[方法]建立大鼠扩张型心肌病模型。给予自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)1.5mg/kg.d腹腔注射共2周。超声心动图检测大鼠心功能改变,HE染色及Masson染色观察心肌病理改变、心肌纤维化程度,Western检测PI3KⅢ途径Beclin1表达水平变化及自噬相关蛋白LC3BⅠ/Ⅱ表达水平变化,电镜下观察自噬小体。TUNEL检测心肌细胞凋亡。[结果]与对照组相比(EF=81.3±3.8%),模型组和3-MA组心功能均下降,分别为(EF=56.1±3.3%)和(EF=58.6±5.4%),3-MA未能改善大鼠扩张型心肌病心功能。3-MA组Beclin1表达受抑制,LC3BⅠ/Ⅱ表达亦减少。电镜下发现3-MA组自噬小体形成受到抑制,但是3-MA并不能改善扩张型心肌病的病理进程及纤维化。TUNEL检测发现3-MA组心肌凋亡水平仍然增高。[结论]3-MA抑制自噬不能改善扩张型心肌病大鼠心功能。抑制自噬的同时,心肌细胞凋亡水平也是增高的。第四部分评估调节自噬水平以改善心功能时心肌细胞凋亡的参与[目的]进一步探讨扩张型心肌病中自噬水平变化的同时心肌细胞凋亡水平的变化。[方法]在TUNEL检测发现除对照组外,其余各组心肌组织凋亡均增加的前提下,进一步通过Western检测心肌组织中凋亡相关蛋白的表达,包括抑制凋亡蛋白BCL2、促进凋亡蛋白BAX及凋亡最终效应分子caspase3的表达。[结果]与对照组相比,各组心肌组织表达抑制凋亡蛋白BCL2均增多,尤其以雷帕霉素4mg组最明显。与此同时,各组心肌组织表达促进凋亡蛋白BAX亦增加,且同样以雷帕霉素4mg组最明显。最终其终效应分子Caspase3表达在各组也均有增加,且以雷帕霉素4mg组增加最为明显,即雷帕霉素4mg组凋亡程度最高。而3-MA组caspase3表达与雷帕霉素2mg组相仿,即3-MA组心肌细胞凋亡水平与雷帕霉素2mg组相仿。[结论]在扩张型心肌病中,雷帕霉素诱导自噬增多的同时,心肌细胞凋亡的水平也增高,尤其以大剂量雷帕霉素为甚,这可以从一定程度上解释大剂量雷帕霉素组心功能反而未能改善的原因。在3-MA抑制自噬的情况下,心肌细胞凋亡水平与雷帕霉素2mg组比无明显变化,在此情况下3-MA组心功能未能改善而雷帕霉素2mg组心功能得到改善,这考虑与3-MA抑制了而不是诱导了心肌细胞自噬有关。因此一定程度诱导自噬能改善扩张型心肌病大鼠心功能。
【作者】谢坤；
【导师】施海明；
【作者基本信息】复旦大学，内科学（专业学位），2013，博士
【关键词】自噬；Lewis大鼠；扩张型心肌病；凋亡；mTOR；雷帕霉素；3-MA；PI3KⅢ；BAX；BCL2；caspase3；

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